FFPE和循环无细胞DNA的多重扩增子测序技术

体细胞突变的检测具有挑战性，因为临床样本中肿瘤含量百分比是可变的，并因肿瘤异质性而复杂化。此外，循环的cfDNA和FFPE样品通常数量有限，FFPE样品也可能高度受损。为了应对这些挑战，我们开发了一种单管、多路扩增子测序方法，使用数百个引物对扩增目标位点，为Illumina®测序生产现成的库。这种两步法——聚合酶链反应，然后进行10分钟的适配器连接——得到120-160 bp长的扩增子，使cfdna大小的DNA片段或损坏的FFPE DNA能够扩增和变异调用。利用这项技术，开发了一个肿瘤学小组，以已知的、临床相关的56个基因突变为目标。例如，针对EGFR耐药，使cfDNA样本中的液体活检监测成为可能。面板设计包括单个外显子(例如BRAF)以及整个基因的综合编码外显子覆盖(例如TP53)，这取决于每个靶基因的等位基因分布。为了验证这一小组，使用10 ng输入DNA测试了一组具有预先验证基因型的对照和临床样本。扩增子文库用qPCR定量，并在MiSeq上测序。对齐和变量调用使用经过验证的、公开可用的工具执行，并手动确认。 Robust detection of 5% mutant frequency was observed for samples, and in performing spike-in experiments, the limit of detection was as low as 1% mutant frequency. The percent on-target bases and coverage uniformity were both >95%, where uniformity is defined as the percent bases covered at >20% of the mean coverage. These results indicate that this multiplexed amplicon panel is an excellent tool to assess multiple oncogenes in limiting clinical samples, enabling high throughput, cost effective NGS analysis.