同源定向修复的合成CRISPR-Cas9系统

CRISPR-Cas9正日益成为应用最广泛的基因组工程工具，因为它易于使用，并且能够在几乎任何感兴趣的位点上引起双链断裂(dsb)。细胞同源定向修复(HDR)途径可用于引入外源性遗传内容，尽管CRISPR-Cas9的这种应用不像利用内源性非同源末端连接(NHEJ)途径来创建基因敲除那么简单。我们使用基于天然细菌CRISPR-Cas9系统的合成双rna方法在哺乳动物细胞中进行基因组编辑，允许快速分析多种化学合成的引导rna。在这里，我们展示了该系统在HDR基因组工程应用中的实用性，并为改进CRISPR cas9辅助HDR提供了指导方针。我们给出了使用短的单链dna作为小插入的供体模板的示例和设计建议。我们发现单链供体DNA的同源臂长影响HDR的效率。我们还演示了使用质粒DNA供体模板进行大插入，使用荧光蛋白融合作为模型。最后，我们概述了用于精确基因组工程的hdr生成细胞系的描述技术和方法。