化学修饰的合成指导RNA在CRISPR-Cas9基因组编辑中的应用

细菌CRISPR-Cas9系统已应用于哺乳动物细胞，通过形成靶向DNA双链断裂有效地破坏基因。Cas9核酸酶使用引导RNA (gRNA)定向到DNA，或作为由DNA靶向CRISPR RNA (crRNA)和反式激活crRNA (tracrRNA)组成的原生双RNA系统，或通过crRNA和tracrRNA融合创建的嵌合单引导RNA (sgRNA)。无dna基因组工程可以通过使用Cas9 mRNA或Cas9蛋白与gRNA实现，包括体外转录(IVT) gRNA，合成sgRNA或合成crRNA:tracrRNA。虽然IVT sgRNA可以引起免疫反应，但合成sgRNA或crRNA:tracrRNA对免疫反应几乎没有影响，并且允许将化学修饰合并到RNA中以提高稳定性。在这里，我们提出了化学修饰合成crRNA:tracrRNA与1到3个2 ' - o -甲基和硫代(MS)在5 '和/或3 '端。这些修饰的rna通过电穿孔与Cas9 mRNA或Cas9蛋白共同传递到细胞中。与未修饰的版本相比，当与Cas9 mRNA一起使用时，发现一些修饰模式显著改善了CRISPR-Cas9基因编辑，但当与Cas9蛋白一起使用时，大多数修饰没有显著增加基因编辑。通过转染试剂介导将这些修饰过的gRNAs传递到表达cas9的细胞系中，其编辑效率与未修饰的合成gRNAs相似，并且观察到某些修饰模式下的细胞毒性。在无毒的修饰中，当与Cas9 mRNA或Cas9蛋白共转染时，一些模式显示出编辑效率的适度提高。总的来说，我们的结果表明，在共电穿孔Cas9 mRNA和合成gRNA的实验中，MS修饰是必需的，但当使用基于脂质的转染试剂时，对编辑效率没有影响。