设计高功能和特异性的引导rna用于敲除，并使用同源定向修复途径实现精确敲入

CRISPR-Cas9系统需要一个Cas9核酸酶和两个短rna，一个crRNA和一个tracrRNA，以引入双链断裂，用于功能性蛋白质破坏(敲除)或插入或替换遗传内容，如选择标记(敲入)。为了更好地理解影响CRISPR-Cas9功能基因敲除编辑效率的参数，我们使用了合成的crrna和tracrRNA，这些crrna和tracrRNA可以快速化学合成，而不需要克隆和测序。我们系统地将> 1100合成的crRNA: tracrnas转染到gfp报告细胞系中，以开发一种预测功能基因敲除的算法。为了最大限度地减少潜在的脱靶，我们开发了一种严格的特异性工具，能够检测不匹配以及使用大多数现有特异性工具通常会遗漏的间隙对准。总之，我们能够设计高功能和特异性的引导rna。此外，我们还扩展了合成crRNA:tracrRNA的使用，通过展示其在敲入应用中的实用性，使用短单链DNA作为小插入的供体模板，如snp，或DNA载体作为大插入的供体模板，如GFP报告子。最后，我们提供了设计这些捐赠模板以获得最佳敲入效率的指导方针。