斑马鱼无dna CRISPR-Cas9基因组工程

CRISPR-Cas9系统允许研究人员快速编辑哺乳动物、鱼类和植物基因组中的功能蛋白敲除基因，从而极大地改变了生物学研究。CRISPR-Cas9系统需要将外源性Cas9核酸酶传递到细胞中，可以通过转染表达质粒、mRNA或蛋白质，也可以通过慢病毒颗粒转导来实现。基于dna的Cas9结构虽然适用于许多应用程序，但可能导致不必要的集成事件。慢病毒传递导致Cas9表达盒整合到细胞基因组中，Cas9质粒转染可能导致在通过NHEJ途径修复基因组DNA时，在双链断裂位点插入载体序列。Cas9 mRNA或蛋白质的使用避免了任何不必要的整合，并结合使用合成的crRNA和tracrRNA，形成了一个完全无dna的基因编辑系统。在这里，我们展示了使用无dna的CRISPR-Cas9试剂对斑马鱼进行基因敲除的成功基因编辑。来自稳定转基因系的斑马鱼胚胎被注射Cas9核酸酶mRNA、合成tracrRNA和靶向GFP的crRNA。错配检测实验证实了高效的基因编辑，并通过丢失GFP荧光证实了成功的功能蛋白敲除。