利用SMA患者ipsc衍生运动神经元的高通量表型筛选鉴定新的命中化合物

脊髓性肌萎缩症(SMA)是婴儿死亡的一种遗传性原因，其特征为下部运动神经元的丧失和骨骼肌萎缩。运动神经元的退化是由生存运动神经元(SMN)蛋白水平不足引起的，它由两个几乎相同的基因SMN1和SMN2编码。大多数SMA病例存在SMN1基因的纯合缺失，并保留至少一个SMN2副本。因此，一个有希望的治疗策略是上调源自SMN2基因的全长SMN蛋白的水平。药物发现筛选平台通常使用SMA成纤维细胞或淋巴细胞，但所识别的分子在SMA小鼠模型中通常疗效有限，特别是挽救运动神经元(MN)变性。因此，来自SMA患者的MNs应该在药物发现的早期使用，以增加识别有效小分子疗法的可能性。在BrainXell，我们建立了快速将SMA患者诱导多能干细胞(iPSCs)分化为大量神经元的新技术。我们还使用基因组编辑将SMN2与纳米荧光素酶(NLuc)报告基因内源性融合，从而实现高通量筛选(HTS)，监测暴露于每种化合物48小时后SMN的表达水平。该测定方法适应了HTS的要求，包括:大批量、1536孔格式、最小的孔间变化、短期培养、自动分配机电镀和低试剂量。应用定量HTS方法，我们以剂量依赖的方式筛选了LOPAC、NPC和MIPE文库(> 6000个化合物)。 After demonstrating feasibility, we expanded the screen to the larger Genesis library (~95,000 compounds) in order to identify novel hit molecules. Compounds that increased SMN2 expression by >20% were considered hits. Analysis of the combined ~100,000 compound qHTS identified 81 hit candidates, which were rescreened in triplicate. Ten compounds increased SMN2 expression by 20% with EC50 <10 μM. We then used an ELISA to validate the increased SMN2 expression after 48h treatment. This screening paradigm identified and validated at least one new hit compound that has promising efficacy, but the potency will require optimization.