减少小RNA测序的偏差

在过去的十年里，人们对动物和植物物种的小RNA库编目以及理解小RNA的生物学功能的兴趣激增。使用基于杂交的方法很难区分密切相关的小rna，因为不完全匹配的小rna可能与引物或固定化探针杂交。这些考虑使我们认识到，高通量测序是大规模小RNA研究中最实用的方法，旨在识别和枚举各种物种和组织中的小RNA。
不幸的是，用于小RNA分析的NGS方法并非没有自己的挑战。目前已有几项研究表明，整个数据集(包括miRBase中的数据集)包含严重的序列偏差，特别是小RNA表达，不能用sRNA-seq准确表示。大量的工作已经投入到识别这种错误陈述的原因上，现在人们普遍认为sRNA-seq库中的偏差主要是在库准备的连接步骤中引入的。具体来说，RNA连接酶表现出对流细胞适配器的序列特异性偏好，导致在sRNA-seq文库中优先包含一些小RNA，而牺牲了其他小RNA。在结扎过程中，简单地使用两个不同的适配器序列可以导致一些microRNAs高达30倍的差异表达。没有一个单一的适配器序列能够有效地连接到所有小rna，这表明目标序列以及适配器序列是偏倚的来源。
我们克服sRNA-seq文库中连接偏倚的方法包括在连接位点使用具有随机序列的适配器池，其中每个适配器序列存在于样本中任何给定小RNA的大量摩尔过剩。实验表明，大多数适配器连接的偏倚是由于邻近目标结的2-4个适配器核苷酸的序列。
使用我们的随机适配器策略，我们用合成的小RNA和从人脑中分离的小RNA制备了小RNA文库并进行了测序。由于连接酶偏差的减少，使用随机适配器的库显示了更均匀的覆盖率。我们将展示为什么我们新的精简小RNA-seq协议对于那些需要使用高通量测序准确评估小RNA丰度的人是至关重要的。