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理解HomoFRET

HomoFRET-FP,不知道烦恼的方法适用于高温超导聚合研究活细胞

福斯特共振能量转移(FRET)是一个流行的工具在生物化学和分子细胞生物学。大多数FRET-based应用程序依赖于hetero-FRET,两个不同的荧光团之间的能量转移,供体和受体。然而,还有一个已知类型的烦恼少,homo-FRET。在这里,两个相同的荧光团之间的能量转移发生,只要他们有一个重叠的激发和发射光谱。
由于供体和受体是光谱方法相同,光谱差异不能被检测到。相反,不同的荧光偏振(FP)可以确定。荧光团兴奋通过偏振光传输发射光的荧光团当在附近找到。烦恼时,发射光线去极化的。因此,FP随距离相同的荧光团。这种方法叫做homoFRET-FP,可以用来分析和量化为和寡聚物的形成相同的蛋白质。
直到现在,homo-FRET已很少应用于大规模筛选(高温超导)。是首选的自组装的研究,由于其相对简单的荧光标签只有一个荧光探针是必需的。然而,只需要一个单一的荧光探针,可以为新的多路复用荧光分析的蛋白质相互作用。因此可预见它将变得越来越流行,也考虑到FP检测很好建立在高温超导由于其灵敏度,同质性和成本效益。另一项优势是实时监测细胞内事件的能力。

HomoFRET-FP标很容易量化。特别是,高灵敏度和低变异性在FP检测需要为了检测甚至小homo-FRET-FP值的变化。
一个新颖的方法使用homoFRET-FP识别药物作用于胰岛素包装在活细胞中。异常的胰岛素分泌有关的疾病如糖尿病和癌症。因此有必要找到药物干扰这分泌过程。在释放到细胞外基质,胰岛素分子紧密成颗粒。这是一个细胞的过程,需要记录在一个细胞背景,共同的生化检测,无法记录包装的变化。然而,细粒度的激素累积与homoFRET-FP能被探测到。

北卡罗来纳州中部大学的研究人员开发了homoFRET-FP-based试验测量细胞内胰岛素包装(Yi纽约et al ., 2015)。所使用的组大鼠胰岛瘤细胞表达了mCherry-coupled pre-pro-insulin。而离散mCherry-insulin不会改变的偏振发射信号,胰岛素紧紧挤在颗粒将mCherry分子之间的能量转移,导致减少了FP(图1)。
这个分析可以很容易地验证通过检测FP PHERAstar®微型板块从BMG LABTECH读者。Bafilomycin,颗粒形成阻断药物,用于调节胰岛素包装。平静的细胞表现出低FP值,表示颗粒密集的胰岛素和homoFRET相应高。Bafilomycin增加剂量依赖性FP值由于包装损失(图2)。
进一步的研究表明,本试验适用于高温超导由于适当的Z的因素和可能在384年自动化和运行分析格式。这使得药物作用于胰岛素的识别处理的1782种化合物(图3)。
可靠地检测到小FP源自不同的包装状态的变化,一个微型板块读者需要稳定测量。由于其能够同时检测极化和un-polarized发射光,在PHERAstar®FSX不仅提供了低数据变化也快读时间。板高度敏感的读者可以很容易地集成到机器人系统及其软件加速计算的IC50值等数据分析。

图1: