细胞培养-良好实践和先进方法

细胞培养是大多数生物学和生物医学研究的重要组成部分。许多实验开始了在体外在转入动物模型之前先进行培养。细胞培养，以及更复杂的适应，比如3 d的文化，也可能会变得更加重要，因为采取措施鼓励动物的替代品研究。细胞培养平台用于的遗传屏幕，药物筛选，成像和传感应用程序和记者化验无论是在已建立的细胞系中，还是在动物或患者来源的原代培养中。

细胞培养也被用于深入了解疾病机制，例如，来自患者的诱导多能干细胞(iPSCs)。iPSCs可以分化为特定的细胞类型，如神经元，神经胶质或肌肉细胞，它隐藏着患者疾病的遗传背景，并作为研究病理生理学的模型。这对遗传病因不确定的散发性疾病特别有用，如神经退行性疾病，这些疾病通常包括家族性和散发性疾病，例如:阿尔茨海默病，肌萎缩性侧索硬化症。

除了它们的研究应用，细胞培养也是一种材料的来源再生医学,因为细胞疗法，并作为一个劳动的马biotherapeutic生产。干细胞和诱导多能干细胞可以潜在地分化成特定器官的细胞，构建成组织，并用于移植。然而，大多数干细胞在再生医学中的应用仍处于临床前阶段临床应用较少这在很大程度上是由于缺乏符合监管标准的质量控制措施。

在细胞培养的各个方面，无论是研究还是医疗应用，实施适当的质量控制以确保高标准是至关重要的。质量控制措施涵盖与所有细胞培养相关的广泛适用实践，如避免污染的良好实验室实践，以及针对特殊应用的更具体实践，如再生医学中的干细胞。

细胞培养的良好“管家”实践

鉴于其对研究的重要性，实验室必须进行质量控制并采用最佳实践来避免培养污染。最佳做法包括在专门的培养室中工作，在层流罩中工作，将窗扇保持在适当的位置，对工作表面进行消毒，并佩戴手套和口罩。未被发现的污染，如被支原体或者污染细胞类型，可以干扰实验，导致误导或有偏见的结果，浪费资源和时间。“实验室或机构可以实施政策来减轻污染，防止错误识别细胞培养的问题，”解释说马修·d·霍尔他是美国国立卫生研究院国家先进转化科学中心(NCATS)临床前创新部门早期翻译部门的主任。在一个最近的一篇论文，霍尔分享了NCATS在降低癌症发病率方面的成功故事支原体感染细胞系样本

“在我们开始测试的第一年，大约13%的培养物检测呈阳性，这是一个与艾滋病病毒感染水平相当的水平文献污染率。然而，在我们实施了定期检测计划后，到第五年，阳性率下降到只有3%左右，”霍尔总结了NCATS的方案。“我们成功的方法是多层次的。首先，我们只接受合作者提供的细胞株支原体。我们自己确认这一接收到的细胞系。其次，我们每月测试所有活性培养物，或从冷冻储存液中解冻后进行测试。第三，这对于高通量筛选是极其重要的，这是昂贵的，预期的细胞系在启动实验之前立即进行测试。您要确保高通量屏幕将产生高质量的结果，不受干扰支原体。”

不幸的是，即使监控协议很好支原体实施后，污染仍可能发生。在这些情况下，NCATS立即破坏阳性细胞系并测试备用小瓶。如果备用小瓶的检测结果也呈阳性，它们也会被同样销毁。“如果我们无法找到未受污染的鱼种，我们确实有一个非常有价值或稀有的鱼种补救方案。我们将这些有价值的污染培养物隔离在组织培养室外的专用培养箱中，并启动plasmocin霍尔解释道。“一旦plasmocin方案完成，我们会对修复的培养物进行几次测试，以确保它是干净的。我们检测两次，因为感染可能会发生反弹。我们还检查了细胞的行为，以验证处理没有影响培养物的性质。我们还分享净化过的和支原体免费培养回原来的实验室。”

除了支原体在测试中，NCATS还验证细胞系身份，作为细胞培养质量控制措施的一部分。这是通过短串联重复(STR)分析，作为细胞起源的指纹。“我认为，有很多关于调换细胞系的警示故事海拉是最著名的污染系之一，”霍尔警告说。“为了避免这种情况，我们还决定实现STR来验证大多数传入的细胞系。自从我们开始进行STR测试以来，在我们检测的186个细胞株中，我们只发现了5个被错误识别的细胞株。”

NCATS的经验证明了一个好的监测方案在降低疾病数量方面的可行性和有效性支原体污染培养和防止使用错误识别的细胞系。“我们在NCATS的首要原则很简单。我们认为，如果能够避免使用受污染的或错误识别的文化而产生巨大错误，那么例行地和频繁地花费相对较少的精力是值得的。一个巨大的错误最终会耗费更多的时间和精力，甚至可能会误导研究方向，”霍尔总结道。

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深度学习监测细胞培养质量控制

干细胞在再生医学中有潜在的用途，但由于缺乏标准化和难以扩大规模，进展受到阻碍。质量控制可以提高协议标准化，增强可伸缩性，并确保区域性满足监管标准。临床应用1例原代人表皮角质形成细胞，用于治疗皮肤烧伤和遗传疾病导致的皮肤脱落。人类角质形成细胞对体外在小鼠3T3胚胎成纤维细胞喂养层上进行扩增。目前，人类角质形成细胞干细胞是由克隆分析它评估茎干和增殖能力。理想情况下，需要鉴定和选择具有高增殖能力的克隆，称为全克隆，它在培养细胞中占不到5%，用于进一步扩增。

“虽然克隆分析是可行的，但它是时间、成本和劳动密集型的，需要专家的判断，这限制了标准化和可扩展性，”解释说小君'ichi Kotoku他是帝京大学医疗保健与技术研究生院的教授。“为了克服这些问题，我们开发了一种基于相位对比成像的自动化、非侵入性方法来识别人类角质形成细胞克隆。这项技术，我们称之为基于深度学习的自动细胞跟踪，或者DeepACT，是与Daisuke南坝东京医科和牙科大学医学研究所干细胞生物学系教授Kotoku解释了这项技术。

DeepACT的灵感来自于之前的工作，该工作发现具有高增殖能力的干细胞表现出一种抑制作用细胞运动特征。重要的是，干细胞速度与增殖能力。“我们意识到，我们可以利用这种特征运动，从显微镜图像中非侵入性地识别具有高增殖能力的干细胞。然而，我们早期的工作进展缓慢，因为干细胞跟踪必须手动或通过运动分析来实现，这是不准确的，”南巴解释说。“我们意识到，如果我们可以使用深度学习等计算方法自动化细胞跟踪，我们就可以识别出增殖能力最强的角质形成细胞干细胞，因此，对皮肤移植最有希望。”

在测试中，深度学习识别人类角化细胞核的准确率为77%，即使在细胞碎片存在的情况下，大多数人的运动也可以被跟踪。自动跟踪执行类似于手动跟踪，但在更高的速度范围内记录了更多的单元格。“我们还发现DeepACT能够评估培养条件。当角质形成细胞干细胞被喂食或补充表皮生长因子时，它们的移动速度更快，”Kotoku指出。“因此，DeepACT可以通过确定最大限度地运动的条件来优化细胞培养。”

最后，DeepACT测试了其检测最珍贵的完整克隆的能力。“我们观察到运动指数，单个细胞运动动力学的度量，是干细胞性的一个很好的预测指标。根据DeepACT的评估，运动指数大于1，表明角质形成细胞干细胞在集落边缘的移动速度比在集落中心更快。”Nanba解释说。“这些菌落产生完整无性系的概率更高。因此，DeepACT通过精确定位最有可能产生最适合移植的干细胞全克隆的菌落，自动进行质量控制。”

Kotoku和Nanba预见了DeepACT等自动化技术在质量控制领域的进一步应用。“深度学习算法可以被训练来识别除了人类角质形成细胞之外的其他细胞。因此，我们可以将我们的系统应用于其他干细胞培养，包括iPSCs。此外，这些技术可以扩展到干细胞培养以外的领域进行评估干细胞产品在再生医学领域，”他们总结道。