聚丙烯酰胺凝胶电泳,它是如何工作的,变异及其应用技术

凝胶电泳是一项基本技术在生物学科实验室,允许大分子的分离,如DNA、RNA和蛋白质。不同的媒体和分离机制允许这些分子的子集被分离更有效地利用他们的物理特性。尤其是蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)通常是选择的技术。

在本文中,我们将考虑页面是如何工作的,如何解释它和它的一些应用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质电泳是什么?

页面是一种分离大分子如蛋白质的技术基于他们吗电泳迁移率,即分析物的能力走向相反的电荷的电极。在页面中,这是由电荷,大小(分子量)和形状的分子。分析物穿过毛孔在聚丙烯酰胺凝胶形成的。不像DNA和RNA,蛋白质负责根据不同氨基酸结合,从而影响他们如何运行。氨基酸字符串也可以形成二级结构,影响他们明显的大小,因此他们能够穿过毛孔。它因此有时可能是可取的变性蛋白质电泳线性化他们之前是否需要更准确的估计的大小。

聚丙烯酰胺的毛孔形成较小的比琼脂糖,用于琼脂糖凝胶电泳。这使它更适合在大型多核苷酸的分离蛋白质DNA或RNA片段,并允许相对较小的分离蛋白质。因此,当人们提到“蛋白质电泳”,分离技术,他们将最常指的是页面。

SDS PAGE和本地页面

页面可以在变性或non-denaturing条件下运行,根据分析的目的。

阴离子洗涤剂,钠十二烷基硫酸盐(SDS),结合热,有时还原剂用于变性蛋白质电泳分离的过程称为之前SDS页面。热破坏氢键,二级和三级结构而还原剂,如β-mercaptoethanol,劈开二硫桥。蛋白质是线性化与SDS和复杂,都有一个类似的质荷比。这就消除了结构和电荷的影响,和蛋白质分离完全的差异的基础上他们的分子量(图1)。这个系统了¹通过乌尔里希·k Laemmli5,通常用于分离蛋白质- - - - - -250 kDa。

图1: 线性化的蛋白质SDS页面。二硫键是减少β-mercaptoethanol而SDS否定质荷比的差异,这样蛋白质分子量的基础上分离。

在本地页面,²这些债券是完好无损,保护蛋白质的高阶结构。因此,蛋白质在凝胶的分布主要受蛋白质的电荷(由其氨基酸序列和决定转录后修饰)和分离的pH值,而不是它的大小在kDa。然而,它允许研究人员分析蛋白质在自然或“本地”状态。这可能是理想的分析结合蛋白或复合物时,例如,当他们是很重要的生物活性仍然完好无损。的目的是保护蛋白质的自然状态,SDS,减少代理和热不用于样品制备和低电压也可能被用于分离。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)是如何工作的呢?

页面分离的基本原理分析物通过通过毛孔的聚丙烯酰胺凝胶使用电流。为了达到这个目标,一个丙烯酰胺- - - - - -bisacrylamide混合聚合(聚丙烯酰胺)的过硫酸铵(APS)。催化的反应中,tetramethylethylenediamine (tem),形成一个净喜欢和孔隙结构,分析物可以通过移动(图2)。总额的百分比越高丙烯酰胺凝胶中,孔径越小,因此,较小的蛋白质能够通过。丙烯酰胺的比例bisacrylamide也将影响孔隙大小,但这通常是保持不变的。较小的孔隙大小也减少的速度小的蛋白质能够通过凝胶,提高分辨率和阻止他们进入运行缓冲迅速当电流应用。

图2: 丙烯酰胺的聚合和交联。APS通过tem导致催化丙烯酰胺的聚合和交联。的总浓度丙烯酰胺组件和丙烯酰胺比bisacrylamide影响凝胶的孔隙大小,因此蛋白质的范围大小,可以解决。

1。设备

无论类型的页面的凝胶被运行,设备设置是一样的。然而,如果你切换SDS页面和本地运行,确保所有设备清洗彻底,或有一个单独的组为每个类型,如果可能的话,避免交叉污染的变性剂到本地分析。玻璃盘、衬垫、梳子(用于创建示例井)和铸造框架需要凝胶。逆电流器和梳子的大小将取决于样品的体积和数量你想跑。重要的是,玻璃板块前彻底清洗和干燥组装防止质量差凝胶凝胶时倒或泄漏。蛋白质残留不可能删除3月凝胶染色时。

运行凝胶电泳槽,电源组和电泳框架(其中包含了当前通过凝胶)也将是必需的。

2。缓冲区

三个类别的缓冲是必要的页面:

• 凝胶铸造缓冲区(用于制造胶)
• 样品缓冲
• 运行缓冲(填充胶槽,电泳发生)

电泳可以利用连续或不连续缓冲系统。³一个连续缓冲系统只有一个缓冲区用于样本,凝胶,凝胶坦克和很少用于蛋白质分析分离往往是分散和不好解决。一个不连续缓冲系统,最常用于蛋白质分离,使用不同的凝胶缓冲区和缓冲区。也包含两层使用的凝胶(叠加和解决凝胶)和不同的孔隙大小和不同的缓冲区组成。不连续缓冲系统往往会产生更高的分辨率分离。

Tris-based缓冲区用于页面。Tris-glycine、bis-tris tris-acetate和tris-tricine添加SDS,用于SDS PAGE, Tris-glycine是最常用的。对于本地页面,tris-borate-ethylenediaminetetraacetic酸(此种)不包括SDS是最常用的。pH、离子强度的差异,除了不同的凝胶百分数,有助于缓冲的不连续。

3所示。这种凝胶

一种蛋白质凝胶形成的两个部分,叠加凝胶和解决凝胶。的作用叠加凝胶是允许样本加载和指导样品解决凝胶的顶部,所以他们都在同一时间进入。样品中的蛋白质就会分开,这样他们就可以“解决”解决凝胶。最佳凝胶百分比取决于蛋白质的大小被分离。比例越低,更大的蛋白质可以通过。比例较低的凝胶(通常约4%总丙烯酰胺)用于分析物的堆积凝胶无论大小,因为它不执行分离。它通常是在一个较低的pH值(约6.8比8.8)比解决凝胶和有不同的离子含量,帮助集中样本分析物紧紧进入解决凝胶。的百分比解决蛋白质凝胶的大小是取决于你想独立,通常7 - 12%下降。梯度凝胶也可能被创建,顶部较低比例的聚丙烯酰胺样品进入,增加样本的路径,以便更广泛的蛋白质大小可以分离。SDS PAGE,缓冲区用于凝胶包含SDS,但本地页面这是省略了。

解决凝胶是倒第一水平略低于梳子。添加聚合代理后,您需要快速凝胶之前开始工作。这种凝胶之间应该用移液器吸取玻璃盘子,避免泡沫的引入,以及一层水化异丙醇(IPA)然后倒上给的优势。一旦设置解决凝胶,倒出来,用水反复冲洗。叠加凝胶现在应该用移液器吸取到顶部和梳子,确保没有气泡。一旦设置,凝胶可以立即使用或存储在冰箱里在一个密封袋用少许水,以避免脱水,直到需要。他们可以存储成功地几天,甚至只要几周,但储存时间越长,他们越会发生扩散两个凝胶层和合成分离可能会受到影响。

预制凝胶可以购买;然而,他们通常更昂贵的比自己做吧。

4所示。样品制备

样品制备取决于你是否执行SDS页面或原生实验。

为SDS页面,样品,如细胞溶解细胞,组织或细菌混合装载染料,其中包含一些重要的成分。染料,如溴酚蓝,可以看到样品在加载和运行。甘油有助于衡量样本和防止它浮动加载期间的良好。SDS和β-mercaptoethanol线性化的蛋白质和否定差异负责。100年混合物加热°C 3分钟通常是足够的,这也有助于变性蛋白质。

为本地的页面、SDS和β-mercaptoethanol不包括加载染料和不执行加热步骤保持蛋白质的天然构象。

加载凝胶之前,样品离心机(16100 x g 2分钟应该足够)去除不溶性的碎片。只是浮在表面的微粒会干扰需要加载的运行样品凝胶。

5。控制

大小标记通常是包含在样本行启用大小估计年底乐队检测。参考蛋白质以及积极的和消极的控制应包括在可能在未知样品验证的观察。从已知应变或细胞溶解产物产生兴趣或纯化目标蛋白的蛋白质可能提供一个适合发展的积极控制。而应变或细胞系一样的未知样本但基因编码目标蛋白质已经被移除的可以提供一个合适的负控制。控制模拟未知样本尽可能可以检查样品时特别有用,没有纯化蛋白,因为它有助于区分背景乐队与感兴趣的人。

6。运行凝胶

填充电泳槽和一个适当的缓冲,经常tris-glycine-SDS SDS PAGE和此种本地页面。

除去凝胶玻璃板之间的(仍然)铸造框架并将其插入到电泳框架。低这仔细到电泳槽和最高运行缓冲,井顶部淹没。把梳子直到你已经准备好运行凝胶,这有助于维持油井的完整性。梳理后,样品应装有一个非常细吸管提示或针。小心不要损坏井的边缘或过载他们否则样品可能车道之间的交叉污染。加载染料结合示例有助于视觉引导这一过程并把样本混合井的底部。

槽上的盖,确保电极周围的正确方法(黑色到黑色和红色,红色)和应用当前的设置。和运行时使用的电压将随比例解决使用凝胶,分析物的大小和SDS或本地分析是否正在运行。通常,200 V 35分钟是一个很好的起点SDS PAGE和100 V 40分钟本地页面(图3)。Prechilling本地页面的运行缓冲可以帮助防止样品加热,限制变性和伤害。

图3: 样品制备蛋白质电泳页面。1)准备样品分析,2)凝胶是演员和设备准备,3)缓冲区添加到凝胶坦克和样品/控件被添加到凝胶,4)目前应用于样品中分离蛋白质,5)凝胶染色和可视化。

7所示。染色和可视化

一旦样品迁移距离足够凝胶,可以被染色前的位置,这种凝胶帧删除从坦克和凝胶是小心翼翼地从玻璃板块中删除。叠加凝胶所做的工作,可以小心地切断和丢弃,只留下解决凝胶。

现在必须的蛋白质通常是通过使用考马斯亮蓝染色^4,5有机染料复合物与基本的氨基酸,染色蛋白质和修复。凝胶通常淹没在染色溶液组成的20% (v / v)甲醇,10% (v / v)冰醋酸和0.1% (w / v)考马斯亮蓝和水组成。凝胶是淹没在污渍大约1 h与温和搅拌(或直到充分染色)(小心不要把凝胶)。加热可以加快这个过程但不要煮的解决方案。然后,洗掉多余的染色;您还会注意到,染料染色聚丙烯酰胺凝胶,尽管一定程度上比蛋白质。因此,凝胶就必须使退色。随着染料结合更紧密的蛋白质比凝胶,染料可以从无蛋白的部分删除凝胶使用类似溶剂染料的染色是省略了。典型的脱色使用50% (v / v)甲醇在水中10% (v / v)醋酸。凝胶可在一夜之间使退色的温和搅拌得到一个清晰的背景,染色蛋白质乐队,但与染色,可以加速通过加热使脱色。 Gels are then rinsed in water and can be visualized immediately; they can be stored in a little water to prevent dehydration.

染色蛋白质的解决方案不需要使脱色是可用的,可以特别有用如果迅速的结果是必需的。然而,他们通常更昂贵的比标准的染色协议。其他污渍,如银染色,⁶还可用于特定目的但Coomassie染色法是最常见的。

解释蛋白质凝胶

当页面凝胶通常与考马斯亮蓝染色检测,它们可以被可视化和审讯用肉眼,与DNA琼脂糖凝胶。可以拿着相机捕获图像提供一个长期记录。标记梯子通常运行与蛋白质样品允许它们的大小(通常在kDa)估计(图4)。重要的是要记下的样本是加载到车道,使之能够准确解释的结果。在本地页面凝胶,大小可能不准确由于二级结构,影响其通过凝胶。在这些情况下,参考蛋白质可能包括让用户知道他们的目标可能会怎么没出现。本地页面也非常有用当样品在相同的凝胶相比,例如,不同的治疗方法,条件或约束力的合作伙伴,寻找差异。带的强度可以表明蛋白质,蛋白质越多,乐队越强。太多的样品是否已被加载,乐队可能出现强烈的黑暗的污点,是很难或不可能的解释。在这些情况下,你应该考虑重复分析样本较少。

图4: SDS PAGE Taq DNA聚合酶。SDS PAGE是一个有用的技术根据其电泳淌度分离蛋白质。标记(左手lane)是精度+蛋白质标准蓝色。这个SDS页面进行确定Taq DNA聚合酶的分子量。信贷:玛尔塔费雷拉,复制下Creative Commons归因2.5通用许可证,Creative Commons Attribution-Share Unported 3.0一样许可证和GNU自由文档许可证。

二维凝胶电泳是什么?

有时,分离的蛋白质在一个维度不足以解决类似的物种。在这样的情况下,分离在二维空间中可以添加所需的分辨能力,因为它不太可能,两个分子将在两种截然不同的属性非常相似。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳,或2 d页面,同时在1975年引入Joachim克洛泽⁷和帕特里克·h·O 'Farrel。⁸

在第一维度、蛋白质分离线性根据他们的等电点(这与他们的收费和pH值)。在第二个维度,分子然后在90年分离°根据分子质量第一分离产生electropherogram(图5)。

图5: 2 d页面的示例。水平蛋白质分离(轴)等电点,纵向(轴)是根据分子量分离。样本来自黄瓜植物致病真菌填充。来源:由米甲Sharo Itayba,复制下Creative Commons Attribution-Share Unported 3.0一样许可证和GNU自由文档许可证。

蛋白质电泳的应用

页面使用在许多生物学科从分子生物学和法医生物化学和基因组学,提供一个重要的分析和诊断工具。让我们考虑一下在哪个页面的一些技术是一个重要组成部分。

蛋白质分析

检查样品直接由页面可以提供一个有用的指标,包括:

• 如果一个预期的蛋白质
• 什么大小(或表观尺寸)
• 大约有多少
• 纯蛋白质样品
• 如果劈理(例如,从一个标记)已经成功
• 这部分蛋白质存在于(例如,从细胞溶解产物分数)
• 蛋白质溶解度

当生产重组蛋白,⁹重要的是能够检查感兴趣的蛋白质没有丢失在净化过程中多个阶段,并出现在预期的大小。根据存在的一部分,它也可以显示如果与蛋白质溶解度可能有问题,这可能会影响其功能或绑定能力或排除的净化条件使用。无关的乐队的净化过程也可以表明污染物的存在。重组蛋白疫苗和生物制药发展是关键,以及诊断分析和研究。

蛋白质分析也很重要对许多学科包括食品和饮料开发、¹⁰质量控制、¹¹安全^12,13和欺诈检测¹⁴和环境样品的分析。^15,16然而,随着技术进步、越来越便宜和容易,有些分析在这些领域所取代¹⁷等技术质谱(MS)。

电泳迁移率改变分析

电泳迁移率改变分析(emsa)是一种重要的实验工具识别核酸- - - - - -蛋白质复合物。这可以帮助识别转录因子结合位点如使用。¹⁸在琼脂糖凝胶经常用来实现这一目标,因为他们允许容易迁移更大的DNA- - - - - -分离蛋白复合物,页面可以提供更大的分辨率和更大的稳定复合物。¹⁹

免疫印迹

分离样品的蛋白质是一个重要的第一步免疫印迹实验和页面通常采用的技术来实现这一点。当页面凝胶涂抹在膜的污点,复制页面凝胶也可能与考马斯亮蓝染色,作为免疫印迹结果解释时加载控制。这些可能是用于诊断传染病和非传染性疾病,评估治疗干预措施的有效性,通知基础研究,检查重组蛋白纯化^20.并提供功能组学研究或validative信息。

提取的质谱分析

一旦分离,蛋白质在凝胶乐队可能切除和纯化进行进一步分析。技术,如女士可以用来获得深度信息的蛋白质样品。

尿蛋白电泳和immunofixation电泳

页面可以提供一个有用的诊断工具来检测某些蛋白质的含量在尿液等体液或血液。琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳对这些分析也可以作为替代品。

通常,应该没有或很少的蛋白质在尿液尿蛋白电泳(UPEP)测试,通常措施白蛋白和球蛋白,可作为病理变化的一个指标。高水平的尿液中蛋白质可以是许多条件包括炎症指标,肾病,^21,22感染和某些类型的癌症(如骨髓瘤)²³,并有助于指导进一步的调查或治疗。

白蛋白和免疫球蛋白²⁴也可以分析血清样本(血清蛋白电泳(SPEP))诊断多发性骨髓瘤等一系列条件,包括癌症,²⁵淋巴瘤和白血病、肾脏疾病、肝脏疾病、malnutritional条件,以及一些神经和免疫条件。

Immunofixation²⁶这些测试可用于识别特定亚型的蛋白,如免疫球蛋白(IgA)λ²⁷或重型和轻型链M蛋白的类型。^28,29日

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