蛋白质生物疗法:质谱分析

质谱技术

生物制药公司对识别新药和发现新的治疗靶点的需求不断增加，这意味着对探索较少丰富的细胞蛋白的治疗潜力有更大的兴趣。这种关注点的转移得益于蛋白质组学领域的重大进步，特别是质谱(MS)的改进。

它能够仔细检查蛋白质的物理和化学稳定性以及蛋白质的药代动力学特性，使其成为生物制药开发过程中使用的实用、灵活的工具。对蛋白质的一级、二级、三级或四级结构的修饰都可能对生物治疗的安全性和整体有效性产生巨大影响，这表明了稳健、多功能生物分析方法的重要性。¹

MS已经发展成为一种流行的技术，用于生物疗法的表征和蛋白质变异和翻译后修饰的鉴定。MS技术的多功能性意味着它可以根据您的分析需求采取许多不同的形式。

蛋白质质谱中最常用的软电离技术有液相色谱/电喷雾电离-质谱(LC-ESI-MS/MS)和基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱。²软电离可以使分析物在整个过程中保持较低的内能，这意味着主多肽骨架保持完整。¹用于生物疗法的初级结构分析的MS工作流程的类型取决于蛋白质及其修饰的性质(图1)。¹


图1:“自底向上”和“自顶向下”MS分析工作流的概述
确定多肽和生物疗法的结构特征。“自下而上”的
方法包括肽消化和使用质谱分析(用于肽
映射/肽批量指纹)或串联ms“自上而下”方法
包括完整的质量分析和串联的蛋白质气相裂解
信贷女士:Leurs等人。

电喷雾质谱耦合²LC允许自动分离和处理，使其成为高级“自下而上”分析的首选MS技术。MALDI-TOF适用于整个生物制药开发的分析，其简单的样品制备和直接的数据分析使其成为肽图谱的流行选择。^3.
蛋白质的质谱生物分析

“最大的好处是MS提供了对分析物的直接测量，而不是依赖于来自一个或多个免疫相互作用的间接信号。”Ian Moore, SCIEX全球技术营销经理，医药定量分析和MetID

更传统的技术，包括配体结合测定(LBAs)已被常规用于血清中蛋白质的定量。然而，当涉及到大规模生物分析时，由于其费用和难以转化为高通量环境，lba在某种程度上是不切实际的，尽管技术和机器人技术的进步使这成为一种更可行的方法。^3.由于在结构相似的蛋白质之间具有卓越的选择性，对高通量设置的依从性，一般的鲁棒性和对特定试剂的需求减少，质谱仍然是首选的分析工具。^3.

“MS平台是普遍适用的:所有蛋白质和多肽都可以通过LC-MS/MS进行评估，而配体结合分析需要针对每种分析物的特定抗体。因此，LC-MS/MS测定具有更宽的线性动态范围(LDR)为4-5，即使在处理含有复杂内源性蛋白质背景的样品时也可以提供选择性数据。LC-MS/MS还具有速度优势:可以在更短的时间内开发和验证方法，并且可以一次分析多个目标。”Ian Moore, SCIEX全球技术营销经理，医药定量分析和MetID

利用质谱研究ADME、药代动力学和代谢物ID

“研究(ADME毒理学、药代动力学和代谢物)以制造有效和安全的药物非常重要。由于其选择性、特异性、通量和敏感性，MS是这三项研究的最佳工具。”Ian Moore, SCIEX全球技术营销经理，医药定量分析和MetID

生物治疗药物的分布和消除是一个主要的挑战，必须注意确定靶点介导的清除、免疫原性和代谢稳定性。信息量最大的研究通常是进行的在活的有机体内并使用质谱技术跟踪药物/代谢物在全身的旅程。

“进行MetID研究是了解整体ADME的重要组成部分。由于代谢物的毒性风险，质谱分析是高级代谢研究的强大工具，重要的是尝试和识别所有潜在的代谢物/分解代谢产物，以确保治疗的安全性。先进的MS技术，如片收购这让我们更有信心，我们甚至可以检测出可能有害的低水平化合物。”Ian Moore, SCIEX全球技术营销经理，医药定量分析和MetID

定量质谱分析在过去十年中不断发展，并将继续成为生物疗法毒理学分析中最有力的方法之一。^3.

糖基化质谱分析

翻译后修饰(PTMs)可以影响蛋白质的活性和结构，引起聚集，最终影响免疫原性和其他药理学特性。因此，重要的是识别和了解这些修改在生物制药生产过程中产生的影响，以确保任何影响都能得到充分控制。⁴幸运的是，MS是检测和分析PTM的有价值的工具。一个关键的好处是它的可重复性、准确性和灵活性;质谱可以与其他技术相结合，如LC或毛细管电泳。⁵它既可以在药物开发管道的早期使用，也可以在最终发布之前的制造和质量控制阶段使用。

糖基化不仅是最复杂的，也是蛋白质中最常见的PTM。更具体地说，60%的生物疗法是糖基化的。⁶在整个生产过程中监测糖基化是很重要的，因为这可能受到许多不同因素的影响，包括所使用的表达系统的类型、细胞培养方案和下游纯化技术。⁷

当你考虑生物治疗时，有两种主要类型的糖基化需要注意:n -链接，其中聚糖连接到天冬酰胺;o -连接，即聚糖连接到丝氨酸或苏氨酸残基(图2)。


图2:模型糖蛋白显示n -链和o -链糖基化。信贷: Dotz等人。

“糖基化被认为是生物疗法安全性的关键特征之一。这源于生物疗法在小鼠细胞中生长的时代，而小鼠聚糖被发现具有免疫原性。如今，监测和操纵生物疗法的糖基化是一种操纵药理学的方法，以提高疗效和安全性。”Sibylle Heidelberger, SCIEX生物制剂公司技术营销经理

为了确保有效性和安全性，生物疗法应该显示人类相容的和一致的糖基化，因此，对n-糖基化进行表征是一项监管义务。⁷监管机构包括美国食品和药物管理局而且欧洲药品管理局，已经制定了评估糖基化在调节生物制药蛋白产品免疫原性方面所起作用的要求指南。

“糖基化可以用三种技术进行分析:保持完整的蛋白质形式来监测糖基化的分布和水平;消化:把蛋白质消化成多肽;并保持位置和糖基化的完整性和聚糖的释放形式来表征和量化聚糖链。不同类型的质谱可以用于这些分析，它们都使用高分辨率质谱仪，如飞行时间(TOF)技术。分辨率和质量精度意味着他们能够精确地分析大的完整的糖基化蛋白，以及分析释放的聚糖和糖肽。这种高分辨率仪器通常也能够进行MS/MS，它可以温和地诱导聚糖和糖肽的特定碎片，从而确认聚糖序列，以及它们所连接的肽的位置和序列。”Sibylle Heidelberger, SCIEX生物制剂公司技术营销经理

质谱分析和工业发展

公司积极主动地不断提高MS技术的灵敏度、分辨率、质量精度和范围，并灵活地将这些技术应用于生物制药过程的各个层面——从早期发现到批准产品的发布，使MS成为生物疗法分析和开发的一个有吸引力和有价值的工具。

“采用新颖的质谱技术对生物制药和其他制造业都很重要。新技术的关键在于它们应该促进和加快分析过程。其结果是允许制造商更快地发布产品，同时保持产品的安全性。”Sibylle Heidelberger, SCIEX生物制剂公司技术营销经理

FDA引入了设计质量(QbD)方法⁸用于监测生物疗法，旨在提高生产过程中产品的效率和设计。

QbD导致了针对每种生物疗法的产品质量属性(PQA)的识别，可以是产品衍生的，也可以是工艺衍生的。因为它们有能力影响药物的安全性或有效性，所以要对它们进行监测。以前，这些属性可以通过ELISA、CEX或HILIC等多种技术单独监测，然而，LC-MS肽图谱用于识别和确认序列和翻译后修饰的发展也导致了单一多属性方法(MAM)的发展，以跟踪和监测关键pqa。”Sibylle Heidelberger, SCIEX生物制剂公司技术营销经理

采用单一方法、单一检测来监测尽可能多的pqa，可以最大限度地提高效率。MS在这一领域发挥着巨大的作用，MS技术的进步将对未来新型生物疗法的发现、开发和批准产生积极影响。