疫苗运输和储存的挑战

2019冠状病毒病大流行使全球关注开发新疫苗的过程，以及运输和储存冷链技术的关键作用。尽管使用了不同的疫苗开发方法，但它们都面临着一个共同的挑战——需要在低温下储存。

对生物药物和疫苗的冷藏或超低温储存的需求并不新鲜，但在2019冠状病毒病大流行期间，需求大幅增加。这意味着冷链行业需要迅速扩大超低冷柜等设备的生产规模，同时确保其可靠性，这一需求一直在持续。它还刺激了行业的创新，消费者寻求更紧凑的产品，具有更好的能源效率和复杂的监测系统，以提醒用户温度波动。对于冷链基础设施面临挑战的发展中国家，研究人员正在开拓新技术，例如太阳能冰箱帮助延长疫苗的保质期。

尽管取得了这些进展，但更稳定的疫苗和无需冷藏运输和储存的疫苗仍然是一个关键目标，目前正在探索各种方法来实现这一目标。

疫苗储存和运输方面的创新

博士。玛丽亚Croyle美国德克萨斯大学分子药剂学和药物输送学教授，正在开发一种薄膜基质，可用于在没有冷链的情况下运输活病毒。她的团队最近开始稳定腺相关病毒(AAV)，这样它就可以在不需要干冰或冷袋的情况下运输。¹市场上有几种食品和药物管理局(FDA)批准的AAV产品;每一种都必须冷冻储存和运输，并在解冻后8小时内给予患者。如果它们在去诊所的路上融化了，它们必须被丢弃。

克罗伊尔说:“我们是第一个记录AAV载体在美国运输的小组，没有任何冷袋或干冰，并让嵌入的病毒在小鼠体内传递基因，就像新鲜制备的病毒一样。”“我们还能够在室温下将活病毒储存在薄膜中长达6个月，而不会降低它们传递基因的能力。”

克罗伊尔的实验室需要克服的挑战之一是薄膜配方的粘度。克罗伊尔说:“目前用于制作薄膜基质的配方具有枫糖浆的稠度，不能轻易通过注射器。”“为了解决这个问题，我们不得不修改配方，以降低粘度，但仍能在室温下稳定病毒。”不幸的是，粘性配方的稳定性更好，但这让团队了解了AAV保持稳定所需的环境。当他们将病毒稳定在粘性配方中并将其稀释到所需剂量时，稀释本身降低了粘度，使其更容易通过注射器。

他们现在计划在更大的动物身上进行额外的测试，然后将该配方应用于目前正在临床测试的AAV产品。克罗伊尔说:“这一概念不仅限于AAV载体。“我们还与合作者合作，在我们的电影中稳定基于mrna的疫苗和各种牲畜疫苗，并计划在明年建立一条试点生产线，使我们能够快速批量生产电影。”

RNA疫苗的储存挑战

首个针对COVID-19的信使RNA (mRNA)疫苗获得批准，为新一波基于RNA的治疗方法打开了大门。但是RNA是一种大的、短暂的分子，必须完全完整才能正常发挥作用，这使得它的稳定性成为疫苗开发人员面临的一个挑战。

“信使rna是不稳定的，因为大自然就是这样设计它的，”达安·克罗默林博士说乌得勒支大学荷兰。“这些都是大分子，核苷酸链只要断裂一次，就会完全失去活性。”克伦默林说，人们正在探索不同的解决方案来解决这个问题，他最近与人合著了一篇关于这些产品的热稳定性和储存的综述。²“一种方法是研究是否可以通过冷冻干燥和优化赋形剂(如lyo保护剂)的选择来稳定mrna -脂质纳米颗粒(LNP)的结构，或者还有另一种选择，即探索配制最终产品的替代方法”，如下所述。

冷冻干燥的方法，冻干，在技术上是一个具有挑战性的过程，但它是RNA治疗领域的公司正在热烈追求的一个。肯尼斯·简Moderna公司的联合创始人、eTheRNA公司董事会成员之一、瑞典卡罗林斯卡学院细胞和分子生物学教授charles charles表示，冷冻干燥复杂mRNA分子的能力已经具备，他希望这项新技术能够应用于开发mRNA治疗方法的每个人，引领疫苗和RNA治疗的新浪潮。“在大流行期间，由于目前的冷链要求，你需要将疫苗送到不同的地方，这是具有挑战性的，对冻干的需求是明确的，但我们也看到对罕见疾病的需求，制造商需要生产更大批量的产品并储存它们，因为患者分布在世界各地。”

优化lnp存储

当社区等待冷冻干燥解决方案时，在欧文实验室在麻省理工学院B.J. Kim博士她为她的学生提出了一个暑期项目的想法，最终产生了一些优化LNP存储的关键见解。^3.

她解释说:“我们试图找到一种有效的方法来储存我们在实验室里制造的RNA疫苗，因为我们必须不断地为我们的研究制造新鲜的RNA疫苗，有时实验的时机不合适。”“我们还需要将疫苗运送出去，在其他设施进行实验，所以我们需要一种有效的方法来储存颗粒。碰巧在这个项目开始后不久，大流行就袭击了我们，我们最终取得了一些非常及时和重要的结果。”

他们系统地改变已知的重要参数:储存温度、冷冻保护剂浓度和缓冲液类型，然后将不同储存条件下疫苗引起的免疫反应与新鲜制备的疫苗LNPs进行比较。“我们发现，对于我们在实验室制造的特定LNP-RNA疫苗，将颗粒储存在10% w/v的蔗糖中，用磷酸盐缓冲盐水和-20°C是最佳方法，储存温度是最主要的因素，”Kim解释说。这证实了COVID-19 mRNA疫苗的结果，但它也揭示了其他重要的见解。“我们意识到，仅仅观察储存前后颗粒的大小并不是疫苗功能的一个很好的指标，因为即使颗粒的结构完整性保持不变，也可能会出现RNA泄漏或降解。”

除了mRNA, Kim和同事们还使用了自我复制或自我扩增的RNA进行了这项工作，RNA一旦进入体内就会自我复制，从而扩大编码蛋白质的生产。这些RNA分子比一个典型的mRNA序列长大约10倍。“我们发现mRNA和自我复制rna之间的存储特性存在一些差异，我们在-80℃时最清楚地看到了这一点°C，”Kim说。“而装载mrna的LNPs在-80℃下储存得很好°C，自我复制的装载rna的LNPs灾难性地聚集。”研究小组认为，这可能与脂质如何聚集在一起并与RNA组织的差异有关，虽然目前还没有一种很好的技术来研究LPN的内部结构，但他们热衷于进一步研究这种现象。

其他提高热稳定性的方法

另一种解决RNA热稳定性问题的方法是现场混合两种主要成分——mRNA在一个小瓶中，载体系统在另一个小瓶中。“如果你采用带正电荷的胶体系统，它们渴望获得mRNA，那么这可以在床边混合，”Crommelin说。“这是针对患者的癌症疫苗的一个特别好的替代方案，因为否则你必须在每个患者每次需要时为他们制作lnp，这使得它更加费力，昂贵和浪费。”根据需要把它们混合起来更容易。”

的进入高级保健研究所专注于全球健康的非营利性生物技术研究机构(AAHI)将这一载体概念进一步推进，开发了一种针对COVID-19的自我扩增RNA疫苗，该疫苗可以冷冻干燥，在室温下至少可以稳定6个月，如果冷藏至少可以稳定10个月。⁴这种疫苗使用了一种纳米结构脂质载体(NLC)，这种载体最初是为了递送寨卡病毒疫苗而开发的。⁵载体与自我扩增的RNA混合，然后立即使用或冷冻干燥。冷冻干燥后，在4°C或25°C，疫苗仍然能够引发免疫反应，产生针对SARS-CoV-2的特异性小鼠IgG抗体，其水平与新混合的疫苗相当。

“我们关注的是疫苗科学实用的一面，也许不那么光鲜亮丽，”他说艾米莉·沃伊特医生他说:“我们在大流行之前就意识到，尽管RNA疫苗对大流行的反应有显著的好处，但显著的缺点——尤其是制造的复杂性和稳定性——将导致它们难以在全球范围内制造和分销。因此，我们专注于开发一种更简单、更有效、更稳定的RNA疫苗技术，并将其应用于Covid。”该疫苗目前正在南非进行临床试验，在世界各地现有的疫苗生产设施中可以直接生产，无需专门设备。Voigt补充说:“我们这个平台的目标是将我们的疫苗产品提供给需要它们的人，以应对这次和下一次大流行，同时考虑到成本和稳定性。”

展望未来

为了真正释放mRNA和其他RNA疫苗的潜力，制造它们的技术将需要在全球范围内更广泛地获得，以减轻冷链上的负担。Chien说:“更有可能的是，疫苗将在大流行开始的地区现场生产。”“我的预测是，我们将在中国、东南亚和非洲看到制造工厂如雨后春笋般涌现，因为制造GMP级mRNA的能力将更快、更便宜、更广泛。”

尽管这些设施仍将需要运输和储存疫苗成分的冷链方面，但通过自动化，整个制造过程也可能更有效率。例如，世界卫生组织一直在为GMP设施开发一种自动化桌面设备，用户可以在那里插入和播放疫苗组件。“这种方法并不适用于所有mRNA药物和疫苗，但我确实认为，随着酶、RNA模板和修饰核苷酸的成本在几年内下降，制造mRNA疫苗的过程很快就会像生产抗体和其他重组蛋白一样成为常规。”这是一个快速发展的领域——生物学中发展最快的领域之一。”

参考文献

1.Doan TNK, Le MD, Bajrovic I，等。热稳定性和在活的有机体内AAV9在薄膜矩阵中的性能。Commun地中海.2022; 2(1): 148。doi: 10.1038 / s43856 - 022 - 00212 - 6

2.Blenke EO， Örnskov E, Schöneich C，等。mRNA疫苗和疗法的储存和使用稳定性:不是一个冷病例。JPharmSci．2022; 0(0)。doi:10.1016 / j.xphs.2022.11.001

3.李建军，李建军，李建军，等。脂质纳米颗粒自复制RNA疫苗储存条件的优化。J控制释放．2023; 353:241 - 253。doi:10.1016 / j.jconrel.2022.11.022

4.Voigt EA, Gerhardt A, Hanson D，等。具有长期室温稳定性的抗COVID-19自扩增RNA疫苗npj疫苗．2022年,7(1):1-13。doi:10.1038 / s41541 - 022 - 00549 - y

5.Erasmus JH, Khandhar AP, Guderian J，等。用于递送复制病毒RNA的纳米结构脂质载体提供单次低剂量的寨卡病毒保护。摩尔其他．2018; 26(10): 2507 - 2522。doi:10.1016 / j.ymthe.2018.07.010