用冷冻电子断层扫描追踪病毒病原体
COVID-19大流行向全世界展示了病毒研究的重要性。多年来对SARS和其他冠状病毒的调查工作被证明是宝贵的基础，使研究人员能够确定SARS- cov -2刺突蛋白的结构，并迅速开发出挽救无数生命的疫苗。
在许多方面，病毒学领域正在经历复兴，许多基本技术在过去十年中迅速发展。除了全球大流行引发的增长之外，另一个重要因素是低温样品保存和分析的标准化和商业化。在这篇文章中，我们将讨论低温电子显微镜(cryo-EM)集成到病毒学研究中，以及在生物安全实验室中与危险病毒物种一起工作所带来的独特挑战。
早期病毒分析
从历史上看，细胞和病毒样本是通过化学固定或结晶来保存的。在整个病毒分析不实际或不可能的情况下，将样本分解成关键蛋白质进行深入的结构分析。虽然这些技术为了解病毒的结构、行为和功能提供了有价值的见解，但它们脱离了病毒活动的原生环境。虽然这对于分离的成熟病毒颗粒是可以接受的，但它给我们对病毒-细胞相互作用的理解留下了空白，特别是当病毒被内化到细胞中时。
为病毒复制而重新编程的细胞机制是一个复杂且高度短暂的过程。即使用化学固定可以实现细胞内成像，捕捉这些稍纵即逝的事件也是一项挑战，特别是有足够的细节来解开正在发生的事情。
低温电子显微镜
在低温样品制备中，水样品被快速冷冻，以便将它们保存在非晶态(玻璃状)冰的悬浮液中。与结晶冰不同，玻璃冰分子通常保持在液相位置，保存样品周围的分子结构。这基本上是标本在接近原生状态下的“快照”。
对于病毒分析，低温保存在一系列电子显微镜技术的发展中发挥了重要作用，这些技术被广泛地描述为低温电镜。其中最常见的是单粒子分析，其开发者被授予2017年诺贝尔化学奖．单颗粒分析使用平均法，从数百张不同样本副本的2D透射电子显微镜(TEM)图像中生成3D分子结构，这些样本在冰中随机定向。它被广泛认为是x射线晶体学的补充，因为它可以很容易地生成蛋白质和复合物的结构，难以结晶。
虽然单粒子分析在结构分析领域占据了重要地位，但它仍然是在与生理环境隔离的碎片系统上进行的。幸运的是，这种需要原位观察可以通过另一种补充的低温电镜技术，低温电子断层扫描(低温et)进行。
冷冻电子断层扫描
在电子断层摄影术中，薄样品逐渐倾斜并在透射电镜内成像。这些图像表示样品的不同截面，可以组合成单个高分辨率的样品3D表示。尽管单粒子分析依赖于同一目标分子的多个副本来捕获其各种方向，但断层扫描必须利用精确阶段，以谨慎的增量可靠地倾斜单个样本。
值得注意的是，这意味着冷冻et可以在整个低温保存细胞的一个片段上进行。虽然早期的冷冻et实验仅限于固有的薄样本(或较厚样本的薄区域)，但各种冷冻稀释技术的出现允许直接在冷冻细胞上切割“窗口”，以窥探它们的细胞内机制。
对于病毒学来说，这提供了一个独特的机会，可以在病毒进入细胞质后捕获难以捉摸的病毒。特别是，冷冻et已被用于研究冠状病毒在细胞内复制的行为。在莱顿大学医学中心的合作下，研究人员能够可视化病毒诱导的双膜囊泡的形成，这些囊泡用于保护病毒RNA复制。这包括囊泡表面的孔隙结构，可能负责RNA运输，标志着它们是潜在的药物靶点。
低温电子断层扫描显示脊髓灰质炎病毒复制的新特征。
脊髓灰质炎病毒感染的海拉细胞的三维断层显像。空衣壳:粉红色，充满rna的衣壳:红色，将衣壳系在膜上的蛋白质复合物:黄色，腔内密度:橙色，与病毒粒子共同包装的致密颗粒:蓝色。图片由Selma Dahmane提供，Umeå大学。
生物安全实验室，与敌人合作
由于病毒病原体对全球人类健康构成的明显而现实的危险，研究人员自然对病原性全病毒和病毒-细胞相互作用的冷冻et非常感兴趣。
然而，生物安全实验室已经确定了各种病毒样本所呈现的危险等级。除非工作仅限于分离的蛋白质或灭活的样本，否则对构成疾病风险的病原体的研究需要更高的生物安全遏制设施。为了确保在这些设施中工作的每个人的安全，研究人员必须采取具体的预防措施并遵守特殊的协议，包括不同的仪器要求(例如设置去污水平)。因此，在这些生物安全水平较高的设施中，尚不常见高端低温电镜仪器。
然而，一些实验室在对致病物种的探索中显示出了有希望的结果。例如，Umeå大学的Carlson研究小组使用了将脊髓灰质炎病毒作为肠道病毒模型进行研究．在他们的工作中，他们能够捕捉到病毒在宿主细胞内的大部分复制周期。他们观察了病毒改变细胞内环境以促进病毒复制的方式。通过可视化这些离散的机制，他们也能够看到细胞防御机制和病毒组装之间的相互作用。例如，抑制自然自噬因子允许病毒继续复制，尽管细胞触发破坏它们。多亏了冷冻et，这项工作才有可能实现，它不仅在治疗发展方面，而且在我们对宿主-病原体相互作用的基本理解方面，开辟了令人兴奋的途径。
“想象一下，跟踪一个病毒，从它与宿主的接触，到细胞结合，一直到复制和释放。就在十年前，这可能被认为是一个异想天开的梦想，但我们正在稳步接近对病毒行为的更全面理解。” - Selma Dahmane, Marie skodorska - curie博士后 于默奥大学
Cryo-ET为研究结构可能已经确定的“已知”病毒以及大量尚未被研究的病毒打开了一扇新的大门。许多关于它们的生命周期和与宿主细胞相互作用的问题仍然没有答案。除了确定病毒结构本身之外，冷冻电镜(包括冷冻et)还可以近距离观察病毒在宿主细胞内的生命周期，例如进入、复制、组装和释放。关于细胞如何对病毒感染做出反应和保护自己，还有很多东西需要了解。同样，研究药物或候选药物对病毒生命周期和细胞防御的影响，可以让我们更好地应对下一个主要病毒。
视角
病毒学正准备进入一个新的发现时代，通过低温保存和分析实现近乎原生状态的观察。特别是冷冻电子断层扫描，可以为我们目前的分子结构和知识提供桥梁细胞相互作用．在更高级别的生物安全设施中安装冷冻电子显微镜将使研究范围更广的病毒种类成为可能。通过全面、多尺度地了解病毒的作用，我们可以设计出更好、更有针对性和更有效的治疗方法。获取这些信息并非没有挑战，但实验人员和仪器开发人员的共同努力一定会推动我们走向这个令人兴奋的未来。
关于作者
亚历克斯Ilitchev是首席科学编辑，材料与结构分析，赛默飞世尔科技公司
克里斯蒂安·瓦德尔是赛默飞世尔科技公司材料和结构分析部的产品营销经理。
