加速发展的优化治疗蛋白质配方使用差示扫描量热法(DSC) |莫尔文Panalytical

DSC数据是有用的预测在溶液中蛋白质的稳定性。T_米表示热稳定性,T_米测定在不同的配方是一个近似测量的敏感性在较低温度下聚合和其他不可逆转的变化。

生物分子治疗在其积极的使用必须稳定,原生形式正确通过政府行动的病人和交付他们的网站。在早期稳定生物制药配方的筛选有助于确保进一步的投资重点是那些展示最好的药物开发潜力。差示扫描量热法(DSC)是一种技术,可以用于快速确定最佳解蛋白配方条件稳定,帮助确定最佳配方的候选人和加快发展。本应用笔记描述莫尔文MicroCal DSC技术及其在制定开发使用。

介绍

生物制药发展的早期决定选择一个生物制药是否会作为液体提供,或者作为冻干(冻干)粉末。一般来说,液体制剂的生产和更便宜,更容易使用,但需要存储在冷藏条件下,往往是不稳定的。冻干蛋白质更昂贵的制造和要求解散政府病人之前,但可以存储在室温和可能提供增强的稳定。方便最终用户也是一个因素,需要考虑(1、2)。制定科学家必须确定蛋白质能够保持稳定在足够的时间内解决方案,或只能在冻干保存稳定形式。

蛋白质在水溶液平衡其原生(折叠)和变性(展开)的构象。疏水相互作用,氢键是主要的稳定力量,必须克服这些蛋白质发生变性。构象熵削弱稳定力量,使生物聚合物(3)展开。蛋白质在加热或展开时变性的化学物质(如十二烷基硫酸钠和盐酸胍)被添加到解决方案。变性蛋白质往往更容易(4 - 7)不可逆的蛋白质水解等化学过程(8),氧化(9)和脱酰氨基作用(10),从而导致失活。变性蛋白质也更容易聚合,聚合同样会导致失去稳定性和分解的蛋白质(11 - 14)。

之前制定的发展,蛋白质的特征。这可能包括确定其分子量、氨基酸组成、三维结构、二硫键,糖基化,需求的代数余子式、抑制剂、溶解度、热力学参数、功能、isoelectic点,疏水性和表面积。所有这些信息是有价值的蛋白质设计的最优配方。使用理性药物设计方法,生物工程蛋白质也可以建造最大的稳定性和选择的解决方案最大的功效。

蛋白质的液体配方应该有利于维护稳定和生物活性的生物高聚物在生产、包装、储存和运输,直到最终交付到目标站点的病人。参数需要考虑在制定开发包括蛋白质浓度、添加剂(辅料),pH值、温度的存储容器,光照,空气和湿度。

另一个因素在制定开发涉及到药物交付机制。例如,一个静脉注射了生物制药需要dilutable,如果蛋白质不溶性,它可以在病人的血液中沉淀。同样,如果药物注入,配方的组成不应导致组织损伤或疼痛病人。进一步考虑潜在的蛋白质吸附到容器或设备表面(注射器、泵等)。

稳定的蛋白质通常是决定使用各种分析方法,包括加速和实时稳定性研究。聚合的程度/沉淀、氧化、蛋白水解降解和/或二硫键洗牌也是典型的评估。运输条件进行测试,以确保交付的药物可以不失去生物活性。

DSC和制定发展

差示扫描量热法(DSC)是一种微量热法技术,用于描述生物分子直接在本土的稳定形式。它通过测量热量变化与分子的热变性当加热以恒定速率。测量热过渡中点(T_米)提供了一个方便快捷稳定的迹象。T越高_米、更稳定的生物分子。

DSC仪有样品室包含生物分子+缓冲区,只和一个参考细胞充满了缓冲。电力供应加热器提高细胞以恒定速率的温度。在这个温度增加,仪器监测样本之间的温差和参考细胞。热吸收的差异之间的细胞都需要保持相同的温度决定了明显多余的热容(图1)。中点的温度(T_米)过渡的焓变化发生在蛋白质从本土变性形式。在T_米,50%的蛋白质处于原生状态,和50%的变性状态,假设两个过渡(图ure1)。一些蛋白质与不同地区的活动或多个结构域可以有多个T_米。科学家可以专注于一个或两个T_米值显示由于配方变化影响最大。

T_米是一种热稳定性的指标,一般来说,T越高_米、更稳定的蛋白质。一个更高的T_米蛋白质不容易展开和变性温度较低。通过询问各种条件和添加剂,DSC可以确定配方最高的T_米将对应的最优配方(s)稳定(4、5、7、15、16)。

在一个化学过程(放热)释放或吸收的热量(吸热)。从本地过渡到变性蛋白通常是吸热的。焓的变化(∆H)的构象转变以集成转变下的面积(图1)。热容(C_p变性的蛋白质通常高于本机,导致积极的∆C_p对热变性(图1)。

图1:典型的DSC热谱。这DSC扫描进行稀释蛋白质溶液,蛋白质经历着一个从一个紧凑,低温自然态展开,高温变性状态。明显过剩的蛋白质测定的热容,基于热容的差异蛋白质的缓冲区,和缓冲。TheTm,∆H和∆Cp的过渡拟合数据计算了使用非线性最小二乘法回归分析两种状态转换模型。

的莫尔文MicroCal™VP-Capillary DSC(图2)和莫尔文MicroCal VP-DSC系统用于生物聚合物的研究解决方案。的莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC系统是专门为T_米多个配方的筛选样本在高吞吐量(50个样品在24小时内),与一个快速扫描速率(250°C / h)。一个完全集成autosampler允许无人操作。参见表1比较功能的莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC和莫尔文MicroCal VP-DSC系统。

# #图2:莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC系统。

表1:比较莫尔文MicroCal VP-DSC和莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC系统
	MicroCal VP-DSC	MicroCal VP-Capillary DSC
活跃的细胞体积	500年μl	130年μl
典型的蛋白质浓度的最低要求	0.02 - 0.1毫克/毫升	0.2 - 0.5毫克/毫升(Tm) > 1.5毫克/毫升(ΔCp和ΔH)
最大扫描速率	90°C / h	250°C / h
温度范围	-10°C到130°C	-10°C到130°C
典型的时间每次扫描	60到150分钟	35到55分钟(取决于扫描速率和温度)
每天最大扫描	4到6(手动)8 h	在24 h ~ 50(无人)
自动化的细胞填充和洗涤	没有	是的
样品每96板	不可用	48

液体制定策略

在制定开发中,主要的问题是找到什么解决方案条件提供本地最大的稳定蛋白质。条件,导致最高的T_米通常保持时间最长的蛋白质在本土国家,在较低的温度。利用DSC、不同pH值和缓冲条件筛选第一,紧随其后的是赋形剂和防腐剂。

缓冲和pH值优化

在图3中,T_米的蛋白质CD40L策划反对博士CD40L的聚集也决定在37°C孵化后7天。T_米优化与聚合的pH值条件最小化(16)。这种pH值之间的相关性,T_米,聚合也与巨噬细胞集落刺激因子(4)。

图3:稳定的行为CD40配体(CD40L)关联聚合反应(A)由尺寸排阻色谱(SEC),和(B) Tm由DSC博士的函数相等的区域代表了最佳pH值范围在Tm是最小化最大化和聚合。(16)。

测量T_米改变蛋白质的DSC是一个相对简单的过程。图4显示了T_米胰凝乳蛋白酶原的变化当pH值增加,衡量的莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC。T_米随着pH值的增加而增加,这表明更大的稳定的原生形式的胰凝乳蛋白酶原pH值更高。

图4:Tm转变的胰凝乳蛋白酶原博士胰凝乳蛋白酶原方案(pH值1.96,2.27,2.57和3.02)准备和添加到96孔板。五个样本用于每个博士匹配引用缓冲区也放置在96板。进行了DSC扫描与莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC。buffer-buffer参考扫描后的DSC数据所示是减法。每个pH值,插图的Tm数据和标准偏差。

赋形剂

辅料是添加剂,可以提高蛋白质的稳定性。包括糖、氨基酸、抗氧化剂、聚合物、醇、甘油和表面活性剂。

一旦确定最佳pH值和缓冲,不同辅料添加到蛋白质的解决方案。如果一个赋形剂增加了T_米、本机形式的蛋白质比没有它更稳定与赋形剂。

赋形剂筛选的液体配方开发期间使用interleukin-1受体IL-1R(5),有两个主要IL-1R过渡,T_米附近48°C和附近的其他66°C。与T的过渡_米在较低温度下被选为辅料的屏幕。的策略是寻找辅料,提高T_米低温的转变,表明积极的改变在本机蛋白质的稳定性。23辅料筛选(表2)。

表2:筛选赋形剂添加到interleukin-1受体
赋形剂	浓度(g / ml)缓冲区	摩尔比率[M_年代/ M_p)*	T_米(°C)
控制__	0.00	- - - - - -	48.1
抗坏血酸	0.05	2037年	36.7
糖
甘露醇	0.0517	2037年	46.7
乳糖	0.0972	2137年	49.7
蔗糖	0.0972	2037年	49.7
葡萄糖	0.0512	2037年	49.6
聚合物
PVP (MW 10 000)	0.01	7	48.9
挂钩(300 MW)	0.0003	7	49.4
挂钩(1000 MW)	0.001	7	49.1
挂钩(3350 MW)	0.00335	7	48.7
右旋糖酐40	0.0392	7	48.0
多元醇
甘油	0.01	779年	48.7
乙醇	0.0051	779年	48.6
乙醇	0.05	7617年	43.8
盐
生理盐水	0.00584	717年	53.1
氯化钙	0.0111	717年	41.1
氨基酸
甘氨酸	0.01	955年	46.2
赖氨酸	0.01947	955年	48.3
半胱氨酸	0.01614	955年	51.3
丙氨酸	0.01187	955年	46.2
精氨酸	0.0232	955年	49.1
表面活性剂
普朗尼克™F68	0.0001	4	46.6
渐变™80	0.001	5	45.8
结合
葡萄糖、氯化钠	0.0512/0.00584	2037/717	52.2
*女士=摩尔的赋形剂/ Mp =摩尔的蛋白质 †控制缓冲20毫米柠檬酸缓冲,pH值6.0。赋形剂添加到该缓冲区。表从Remmele R.L. et al。(5)。

离子强度

缓冲区的离子强度调整来确定增加T_米可以通过添加盐。IL-1R, 100毫米氯化钠的稳定影响最大,在适度的离子强度将T_米从48°C到53°C。这种稳定效应提出了一个盐离子和带电团体之间的直接相互作用的蛋白质(5)。T_米IL-1R继续增加,增加盐,甚至当氯化钠是1500毫米,远高于饱和所有带电站点所需的浓度(图5)。这些数据表明,盐离子影响水结构,也在蛋白质构象稳定性中发挥作用。charge-charge相互作用,改变水的结构,添加本地IL-1R结构稳定。

图5:情节的Tm IL-1R添加氯化钠。100毫米的浓度由虚线所示。(5)。

防腐剂

当药物使用的格式提供,防腐剂添加到帮助防止微生物的生长。然而,这些防腐剂可能有不稳定影响蛋白质。防腐剂对T的影响_米IL-1R也检查(5),防腐剂间甲酚、苯酚和苯甲醇IL-1R政局不稳,基于的转变温度转换到较低的温度(表3)。DSC数据确定的顺序IL-1R稳定性在三种防腐剂-苯酚产生最高的T_米,其次是间甲酚和苯甲醇。DSC稳定性数据还与IL-1R聚合,以尺寸排阻色谱(SEC)。T越高_米,聚合后观察7和60天。

表3:防腐剂对IL-1R的影响:Tm和尺寸排阻色谱法的比较
	DSC			证券交易委员会
	DSC			7天		60天
	Tm1 (°C)	Tm2 (°C)	Tm3 (°C)	gg %	本机%	gg %	本机%
控制	50.8	53.7	66.3	0.66	98.93	1.50	97.54
0.065%的苯酚	50.3	53.4	66.5	1.02	98.62	3.07	96.02
0.1%间甲酚	48.4	51。	65.8	1.37	98.25	5.1	93.92
0.9%苄醇	45.2	48.5	63.6	2.93	96.92	16.46	83.09
控制解决方案:20 mM柠檬酸钠缓冲,pH值6.0,100毫米氯化钠。尺寸排阻色谱(SEC), IL-1R溶液储存在色谱前37°C表示时间。gg % = %聚合,由集成高分子量蛋白质的峰后交会;% = % IL-1R本族,由集成主要蛋白质的峰后秒。(5)。

最佳配方的候选人,根据T_米筛选,然后评估加速稳定性研究。蛋白质在不同的配方,然后储存在37°C。聚合的数量是由尺寸排阻色谱法加速稳定性研究,期间间隔和蛋白质利用sds - page分析检查蛋白质水解。

最后,最好的配方候选人必须接受实时稳定性研究来确定蛋白质的保质期。整个研究和分析生物测试执行,确保蛋白质仍然是活跃的和可行的。

DSC已经被用来作为筛查工具来评估蛋白质稳定在制定发展多年,和使用自动化莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC允许更快的筛选与增加吞吐量比莫尔文MicroCal VP-DSC(表1)。莫尔文MicroCal VP-Capillary DSC被用来确定T_米蛋白质在不同的小灵通和辅料,T的变化_米与美国证券交易委员会(SEC)数据,支持使用DSC作为稳定筛选工具(17)。

总结

DSC数据是有用的预测在溶液中蛋白质的稳定性。T_米表示热稳定性,T_米测定在不同的配方是一个近似测量的敏感性在较低温度下聚合和其他不可逆转的变化。配方的耐热性最好的选择进一步稳定,保质期,和运输的研究。DSC的使用可以节省时间和金钱在制定开发中,和完全自动化的系统使在这一重要领域提高效率和生产力的药物开发。